Tiempo de retención

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El tiempo de retención (tR) es el tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra hasta la aparición del máximo del pico de un componente en el detector.[1][2][3] La IUPAC lo denomina tiempo de retención total y lo expresa también como el volumen de fase móvil que entra a la columna entre la inyección y la salida del máximo del pico.[4] Para un sistema cromatográfico determinado, cada compuesto presenta un valor propio de tR, razón por la cual esta magnitud permite una identificación tentativa por comparación con un compuesto conocido.[5]

Origen del tiempo de retención

Los componentes de una muestra avanzan por la columna a velocidades distintas porque se distribuyen de manera diferente entre la fase estacionaria y la fase móvil. Mientras una molécula permanece en la fase estacionaria no se desplaza; solo avanza cuando se encuentra en la fase móvil. Un compuesto que pasa la mayor parte del tiempo en la fase móvil sale primero y uno que permanece más tiempo en la fase estacionaria sale después.[6] Esa distribución depende de la composición de la fase móvil, de la composición de la fase estacionaria y de la temperatura de separación.[7]

La señal del detector en función del tiempo o del volumen de fase móvil eluido constituye el cromatograma, en el cual cada componente separado aparece como un pico. El tiempo de retención se mide desde el instante de la inyección hasta el máximo de ese pico.[2] Según el glosario de Agilent, el tiempo de retención suele medirse hasta el ápice del pico, pero en los picos asimétricos debe medirse hasta su centro de gravedad.[8]

Expresión matemática

El tiempo de retención se relaciona con el tiempo muerto y con el factor de retención mediante la ecuación

donde:

  • tR es el tiempo de retención del componente;
  • t0 es el tiempo muerto, es decir, el tiempo que tardan en llegar al detector los solutos que no interactúan con la fase estacionaria y se desplazan a la misma velocidad que la fase móvil;[9] la IUPAC y la USP lo denominan tiempo de retención de un compuesto no retenido (hold-up time) y lo representan con tM;[4][3]
  • k es el factor de retención, cociente entre la cantidad de soluto en la fase estacionaria y la cantidad en la fase móvil. En textos antiguos se denomina factor de capacidad (k′); la IUPAC indica que el apóstrofo no es necesario y que sus nomenclaturas siempre han usado k.[10][11][3]

Reordenando la ecuación se obtiene ; la diferencia tR − t0 recibe el nombre de tiempo de retención ajustado.[12] La IUPAC establece que en cromatografía de líquidos no se aplica la corrección por compresibilidad de la fase móvil, por lo que los tiempos de retención total y corregido son iguales, y también lo son el ajustado y el neto.[13] La ecuación muestra que tR es igual a t0 cuando k = 0, es decir, cuando el compuesto no se retiene, y que es mayor que t0 cuando k > 0. Además, como t0 varía de forma inversa con la velocidad de la fase móvil, tR también disminuye cuando aumenta el flujo.[5] Si el flujo se modifica en un factor x, el tiempo muerto cambia en el factor 1/x.[5]

Cromatograma esquemático. La línea gris discontinua marca la inyección; la flecha gris señala el tiempo muerto (t0) y las flechas azul y naranja, los tiempos de retención (tR) de dos compuestos retenidos. Diseño propio basado en Snyder y Kirkland (1979), cap. 2, pp. 21–24, e IUPAC (1993), p. 841.

El tiempo muerto y su medición

El valor de t0 que se usa en la ecuación depende de cómo se determine. Según la IUPAC, el tiempo muerto medido incluye los volúmenes aportados por el inyector, el detector y las conexiones, además del volumen de la columna.[4] Agilent indica que, en fase reversa, el uracilo se emplea con frecuencia para medirlo, y que el tiempo muerto de la columna es el cociente entre el volumen muerto y el flujo.[14] El mismo documento describe una estimación a partir de la primera perturbación de la línea base en el cromatograma.[15]

La revisión de Rimmer, Simmons y Dorsey señala que la medición del volumen muerto en cromatografía de líquidos de fase reversa no ha alcanzado un acuerdo unánime y que no existe un límite definido entre la fase móvil y la fase estacionaria, porque la fase enlazada se solvata con la fase móvil.[16] Los autores indican que muchas moléculas orgánicas pequeñas presentan tiempos de elución que aumentan al disminuir la fuerza de la fase móvil, lo que evidencia cierta retención y produce un volumen mayor que el volumen muerto «verdadero».[17] Como el factor de retención se calcula con t0, la elección del marcador modifica el valor de k y, por ello, la relación entre tR y t0.[16]

Consecuencias prácticas en el laboratorio

  • Dependencia del flujo. Dos corridas del mismo método con flujos distintos producen tiempos de retención distintos. El volumen de retención, que es el volumen de fase móvil que sale entre la inyección y el máximo del pico, se obtiene como el producto del tiempo de retención por el flujo volumétrico y no varía con el flujo, por lo que resulta más adecuado cuando se requiere un valor de retención independiente del flujo que entrega la bomba.[18][2][3]
  • Anchura del pico en elución isocrática. En elución isocrática, la anchura de los picos aumenta con el tiempo de retención, de modo que los componentes que eluyen tarde producen picos más anchos.[19] Véase Elución isocrática y en gradiente.
  • Volumen de retardo en gradiente. Agilent indica que el volumen de retardo no afecta la retención en métodos isocráticos, pero sí la modifica de forma importante en métodos con gradiente; si un método con gradiente se traslada de un instrumento a otro y los tiempos de retención cambian, conviene comparar los volúmenes de retardo de ambos sistemas.[15] Véase Volumen de retardo.
  • Identificación tentativa. La coincidencia del tiempo de retención de una señal desconocida con el de un compuesto conocido, en el mismo sistema, es un indicio de que se trata del mismo compuesto, pero no lo demuestra: puede ocurrir que ningún compuesto conocido coincida o que más de uno presente un tiempo de retención similar. La identificación positiva requiere aislar la señal y caracterizarla con otras técnicas.[20] Véase Análisis cualitativo en HPLC.
  • Picos que se traslapan. Cuando dos picos están poco resueltos, el máximo aparente de cada uno se desplaza hacia el pico vecino y el tiempo de retención medido contiene un error.[20] Véase Resolución cromatográfica.
  • Sobrecarga de la columna. Si la cantidad inyectada supera la capacidad lineal de la columna, los factores de retención dejan de ser constantes y los tiempos de retención ya no sirven para el análisis cualitativo por comparación con patrones.[21] Véase Capacidad lineal de la columna.
  • Uso en la aptitud del sistema. Los tiempos de retención y las retenciones relativas que aparecen en las monografías de la USP se indican con fines informativos, salvo que la monografía establezca otra cosa, y a las retenciones relativas no se les aplican criterios de aceptación.[22] Rimmer et al. señalan que, en la industria farmacéutica, el factor de retención se emplea como indicador de aptitud del sistema porque cambia cuando la columna envejece y pierde fase enlazada.[16] Véase Aptitud del sistema.

Cuestionario de autoevaluación

1. ¿Desde qué instante y hasta qué punto del pico se mide el tiempo de retención?

Se mide desde el instante de la inyección de la muestra hasta el máximo del pico del componente en el cromatograma.

2. Un compuesto tiene un tiempo muerto de 1.5 min y un factor de retención k = 2.0. ¿Cuál es su tiempo de retención?

Se aplica tR = t0 (1 + k), de modo que tR = 1.5 min × (1 + 2.0) = 4.5 min. Si el compuesto no se retuviera (k = 0), su tiempo de retención sería igual al tiempo muerto.

3. Un analista observa que una señal desconocida y un patrón tienen el mismo tiempo de retención en el mismo sistema. ¿Qué puede concluir y qué no puede afirmar?

Puede concluir que la coincidencia es un indicio de que se trata del mismo compuesto, es decir, una identificación tentativa. No puede afirmarlo de forma definitiva, porque más de un compuesto puede tener un tiempo de retención similar; la identificación positiva requiere aislar la señal y caracterizarla con otras técnicas.

Véase también

Ficha de documentación

Referencias

  1. ↑ Snyder, L. R.; Kirkland, J. J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2.ª ed. Nueva York: Wiley-Interscience, 1979, cap. 2, p. 21.
  2. ↑ 2,0 2,1 2,2 Harvey, D. Modern Analytical Chemistry. Boston: McGraw-Hill, 2000, cap. 12, p. 548.
  3. ↑ 3,0 3,1 3,2 3,3 United States Pharmacopeial Convention. 〈621〉 Chromatography. Texto armonizado (etapa 4), oficial desde el 1 de diciembre de 2022. USP–NF, sección «Definitions», p. 12 del PDF de armonización.
  4. ↑ 4,0 4,1 4,2 Ettre, L. S. Nomenclature for chromatography (IUPAC Recommendations 1993). Pure Appl. Chem. 1993, 65 (4), 819–872, p. 841.
  5. ↑ 5,0 5,1 5,2 Snyder, L. R.; Kirkland, J. J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2.ª ed. Nueva York: Wiley-Interscience, 1979, cap. 2, p. 24.
  6. ↑ Snyder, L. R.; Kirkland, J. J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2.ª ed. Nueva York: Wiley-Interscience, 1979, cap. 2, pp. 17–18.
  7. ↑ Snyder, L. R.; Kirkland, J. J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2.ª ed. Nueva York: Wiley-Interscience, 1979, cap. 2, p. 18.
  8. ↑ Agilent Technologies. The LC Handbook: Guide to LC Columns and Method Development. Publicación 5990-7595EN, 2016, p. 162.
  9. ↑ Harvey, D. Modern Analytical Chemistry. Boston: McGraw-Hill, 2000, cap. 12, p. 549.
  10. ↑ Snyder, L. R.; Kirkland, J. J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2.ª ed. Nueva York: Wiley-Interscience, 1979, cap. 2, pp. 23–24.
  11. ↑ Ettre, L. S. Nomenclature for chromatography (IUPAC Recommendations 1993). Pure Appl. Chem. 1993, 65 (4), 819–872, p. 843.
  12. ↑ Harvey, D. Modern Analytical Chemistry. Boston: McGraw-Hill, 2000, cap. 12, p. 551.
  13. ↑ Ettre, L. S. Nomenclature for chromatography (IUPAC Recommendations 1993). Pure Appl. Chem. 1993, 65 (4), 819–872, p. 842.
  14. ↑ Agilent Technologies. The LC Handbook: Guide to LC Columns and Method Development. Publicación 5990-7595EN, 2016, p. 146.
  15. ↑ 15,0 15,1 Agilent Technologies. The LC Handbook: Guide to LC Columns and Method Development. Publicación 5990-7595EN, 2016, p. 58.
  16. ↑ 16,0 16,1 16,2 Rimmer, C. A.; Simmons, C. R.; Dorsey, J. G. The measurement and meaning of void volumes in reversed-phase liquid chromatography. J. Chromatogr. A 2002, 965, 219–232, pp. 219–220.
  17. ↑ Rimmer, C. A.; Simmons, C. R.; Dorsey, J. G. The measurement and meaning of void volumes in reversed-phase liquid chromatography. J. Chromatogr. A 2002, 965, 219–232, p. 224.
  18. ↑ Snyder, L. R.; Kirkland, J. J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2.ª ed. Nueva York: Wiley-Interscience, 1979, cap. 2, p. 25.
  19. ↑ Agilent Technologies. The LC Handbook: Guide to LC Columns and Method Development. Publicación 5990-7595EN, 2016, p. 56.
  20. ↑ 20,0 20,1 Snyder, L. R.; Kirkland, J. J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2.ª ed. Nueva York: Wiley-Interscience, 1979, cap. 2, pp. 43–44.
  21. ↑ Snyder, L. R.; Kirkland, J. J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2.ª ed. Nueva York: Wiley-Interscience, 1979, cap. 2, p. 27.
  22. ↑ United States Pharmacopeial Convention. 〈621〉 Chromatography. Texto armonizado (etapa 4), oficial desde el 1 de diciembre de 2022. USP–NF, sección sobre aptitud del sistema, p. 16 del PDF de armonización.
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